刘沛博士分享：揭秘液体活检，一管血的故事！
液态活检已成为临床肿瘤学的“显学”
国内当前液体活检领域是一个什么现状？其学术意义和临床应用前景也越来越明朗。液态活检按照检测对象分类，主要可以分为核酸层面的ctDNA和细胞层面的循环肿瘤细胞（CTC）以及外泌体。
液体活检已经被MIT Technology Review杂志评为2015年度十大突破技术之一，2015年12月《NSCLC血液EGFR基因突变检测中国专家共识》规范中国EGFR血液检测，推动肺癌精准治疗，这无疑显示了这项技术的巨大进步以及在临床应用中的巨大潜力。可能在几年前，液态活检技术还仅限于科研层面，但现在凭借着检测技术的发展与成熟，这项技术已经迅速在医疗行业内应用开来，比如NIPT。
目前国内的企业在液态活检领域主要集中在CTC和cfDNA，外泌体还鲜有涉及。外泌体一词最早出现在1981年（Biochim.Biophys.Acta.645,63-70,1981），但是直到2007年发现外泌体可作为细胞间基因交流的机制（包括mRNA和miRNA），才重新激发了人们对外泌体领域的兴趣（Nat. Cell Biol. 9, 654–659, 2007）。CTC的富集主要包括物理学、免疫学以及材料学，检测方法包括分子生物学、免疫学和流式细胞术等。主流的cfDNA检测技术主要包括ARMS-PCR和NGS，其他的还有数字PCR、BEAMing、CAPP-seq等。数字PCR虽然有更高的灵敏度且可定量，但是由于多种原因，现阶段在临床上并不容易推广，如仪器牌照问题和配套试剂成本的问题。
今天我主要分享液态活检在肿瘤领域的应用。相信很多人都看到了2016年发布《2012年中国恶性肿瘤发病和死亡分析》报告，其中肺癌每年新发病例数为70多万。火石地图对液态活检的市场规模预计有216亿元。一方面我们会为肿瘤发病率震惊，另一方面我们又在感叹市场规模。
言归正传，回到主题。
传统的肿瘤检测方式存在许多局限：例如组织活检，需要患者进行手术从肿瘤上取样切片，这给患者带来很大痛苦，并且不能频繁进行。它只能对单一器官进行检测，局限性也非常大，不适合在常规体检时使用。更严重的是，从肿瘤上切片提取组织会对肿瘤进一步刺激，容易激发癌细胞的快速增长。
液态活检的好处在于，它可以使医生频繁监测肿瘤的发展：只需通过抽血，就可以在人体的循环血液中检测ctDNA(死亡肿瘤细胞上脱落释放的小片段肿瘤基因)从而快速确定一项治疗方案是否适合患者。如果治疗方案无效，可以立即放弃，避免患者遭受副作用之苦，也可以让医生尽早尝试替代方案。
液态活检技术在临床上应用主要有：1. 检测晚期患者的突变信息，找到有效的靶向药物；2. 动态监测正在服用靶向药物的患者，检测是否发生耐药突变，指导换药；3. 早期筛查肿瘤，防“未病”。
液态活检是一种技术，更是一种临床解决方案。在液态活检的背景下可以有很多应用，包括临床和面对消费者。当前基因检测的靶点主要包括DNA的突变、基因扩增、基因融合、缺失/插入等，这种是一种不可逆的变化。
而DNA的变化远远不止这些，一些表观修饰会对基因功能产生影响，进而影响细胞功能和个体健康，如基因启动子区的甲基化发生在多数情况下会抑制转录因子与启动子的结合，激活或抑制基因的功能。拿一个常见的例子说明，很多人喜欢健身塑体，在肌肉的强化过程中，就包含了特定基因的甲基化动态变化过程。这种动态监测过程，不可能多次获取组织，通过无创的液态活检可以实现多次、实时的监控。我们会逐渐发现这种技术会在很多层面的应用。
鑫诺美迪在液态活检领域主要检测标志物是ctDNA，技术平台包括AMRS-PCR和NGS。首先我们关注ctDNA，是因为ctDNA在临床上更容易推广应用，从抽血到提取ctDNA并不需要额外设备，只需严格按照操作说明即可得到高质量的ctDNA。
CtDNA的检测，大家可能更关注采用什么技术平台去完成，但是鑫诺美迪更关注的是流程。首先鑫诺和合作单位设计了高效率的ctDNA提取，更高效的富集血浆中的ctDNA，这也是后续检测的源头，我们目前只需要提取200-600uL血浆中的核酸即可满足后续检测。在检测的技术平台上，鑫诺对ARMS-PCR和NGS技术的关注点也不同。对于ARMS-PCR技术，我们更多要求的是灵敏度和特异性，我们对传统的AMRS-PCR技术进行了改进，该技术命名为AMRS-PLUS。
ARMS-PLUS技术的特点是在扩增体系内加入了独有的反应因素，可使在反应中主动扩增突变靶点，而摒弃野生型靶标，可大幅提升反应的灵敏度和特异性，如EGFR最常见的19 del和L858R突变，可达到0.1%的灵敏度；对于T790M突变，我们可达到0.5%的灵敏度。为了完成AMRS-PLUS设计，鑫诺考虑了PCR体系的热力学和二级结构对反应体系的影响，形成了独特的设计方案，目前已应用在更多的产品设计，我们希望最终形成一个设计软件，帮助我们更有效率的完成产品开发。
对于NGS技术，我们除了灵敏度和特异性的基础要求外，我们更多的追求的如何提供更全面的检测内容和临床报告。虽然NGS给多数人的感觉是“无所不能”，但是NGS技术特别是扩增子测序对于融合基因的检测还有很大的缺陷，达不到临床上对该技术的期望。鑫诺目前正在和Stanford进行相关的技术合作，期望解决这一问题。鑫诺正在和Stanford的专家攻克一些关键技术细节，其核心是提高cfDNA中可检测的有效模板数目。
我关注北美的企业比较多，所以我在这里举个相关的例子。美国的行业巨头FMI（罗氏先后收购了FMI和CAPP-medicine，并对其进行了整合）主推的产品FoundationOne主要应用领域就是液态活检。该产品利用下一代测序技术对来自常规肿瘤样本的癌症相关基因进行分析，检测315个肿瘤相关基因以及28个常见融合基因的内含子。
我个人认为，在ctDNA检测上，国外目前的优势并不是技术上的优势，最起码不是明显优势。其主要优势还是在其对产品的设计和深度临床验证上的。还拿FMI举例，该公司和纪念Sloan Kettering癌症中心（MSKCC）的合作者发表了一项研究，描述FoundationOne Heme的验证结果，可能有助于该检测在临床肿瘤实践中的应用。在这项研究中，Foundation Medicine分享了来自其CLIA认证、NYS批准的实验室的3696例恶性血液病的基因组分析临床数据，通过大样本大数据的临床验证，使得该产品有形成肿瘤基因谱的金标准趋势。
在液态活检中的外泌体领域，美国企业具有技术领先优势，如Codiak BioSciences（2015年11月获得8000万美元启动资金，检测胰腺癌癌细胞外泌体中所包含的一种蛋白Glypican-1，这种蛋白有可能作为一种非侵入性诊断和筛查处于适合手术治疗阶段的早期胰腺癌）；Exosome Diagnostics（在2010年5月获得2000万美元的A轮融资。在2014年开启B轮融资，分3次完成，2014年3月获得2700万美元，2015年9月获1760万美元，2016年1月获1600万美元，至此B轮融资结束，累计获得6000万美元。B轮融资主要用于将首个癌症诊断产品推向市场，同时扩大诊断疾病范围，目前已推出多个诊断产品；针对外泌体获取传统上依赖高速离心法，该公司开发了柱式提取外泌体技术，已转让qiagen生产）；Exovita Biosciences（其开发基础是癌组织周围的健康细胞分泌的外泌体具备毒杀癌细胞的能力）。
技术进步是基因检测行业的核心推动力，我们可以看到越来越多的国内企业开发了/正在开发具有核心知识产权的技术和方法，提高检测效率和降低成本，这对整个行业的进步有积极影响。
之前也提到了《非小细胞肺癌（NSCLC）血液EGFR基因突变检测中国专家共识》的发布。
随着医学诊断技术特别是分子诊断技术的不断提高，针对肺癌的新的驱动基因不断被发现，基于驱动基因的新型靶向药物不断涌现，肺癌精准治疗成为了关注的热点。该共识由笔者及专家小组精心筹备并完稿，也是中国第一个NSCLC血液EGFR基因突变检测专家共识，旨在规范中国肺癌EGFR血检，推动血检在全国范围内的广泛应用，促进中国肺癌的精准治疗。
欧洲药物管理局(EMA)和中国食品药品监督管理总局(CFDA)于2014年9月和2015年2月先后批准对吉非替尼说明书进行更新，在推荐所有NSCLC患者均应接受肿瘤组织EGFR突变检测的基础上，补充了如果肿瘤标本不可评估，则可使用从血液(血浆)标本中获得的ctDNA进行评估，尽可能明确最可能从吉非替尼治疗中受益的NSCLC患者。
随着临床基础研究的广度和深度的加强，国家和家庭对健康的重视程度变化，会有更多推动基因检测行业发展的政策推出。包括2016年3月卫计委发布文件：对于未列入《医疗机构临床检验项目目录（2013年版）》，但意义明确、特异性和敏感性较好、价格效益合理的实验室自建的临床检验项目（LDTs），应及时论证以满足临床需求。这些都表明国家从政策层面会大力推荐基因检测行业的发展，这也符合新技术在市场上的发生发展过程。大家今天在这里讨论液态活检，从另一个角度说明这是符合市场趋势的。
上述是从行业政策来说未来基因检测的发展，还有一个很重要的问题是靶向药物在多大程度上入医保或商业保险。毕竟基因检测，特别是肿瘤检测的主要目的是指导临床用药。
从分子诊断到液体活检领域的战略考虑
鑫诺美迪有一个很伟大的目标也很现实的目标：为患者提供更全面的检测，为临床提供更全面的信息。
我们的一位患者的案例：一名52岁男性患者，体检发现胃部、胆囊内隆起性病变10余天后入院。胃镜考虑胃体SMT（考虑间质瘤可能）。后行胃壁肿物切除术，术后病理诊断为胃肠道间质瘤，中危。该患者进行C-KIT和PDGFRa检测，发现C-KIT的11号外显子缺失突变，服用伊马替尼效果良好；8个月后，肿物复发，抽取外周血进行消化道系统肿瘤检测panel检测，发现C-KIT和PDGFRa基因均为阴性，但是发现患者肿瘤携带BRAF V600E突变，且呈强阳性。此种GIST，约仅占所有GIST的1%，文献报道此类患者的预后和治疗情况，仅1例BRAF V600E GIST患者接受达拉菲尼治疗后24周，肿瘤缩小了20%。
在液态活检出现之前，对检测样本的获取主要通过是手术、活检等侵入式方法获取，从天然上限制了技术的临床应用以及受益患者的群体。在《专家共识》中提到2012年我国肺癌EGFR突变受检率约为20%~30%，明显低于发达国家或地区的受检率，其主要限制就是组织来源。
从本质上说，液态活检是分子诊断在样本来源上的延伸，是分子诊断市场容量的扩容，是实现为患者做出更好诊断服务的切入点。
之前在临床上确实有很多患者不再适用取组织而无法实现精准检测，我们感到很遗憾，作为医疗行业从业者，我们都希望患者能够从我们的技术中获益。当我们看到这种机会出现时，我们很自然的会切入液态活检领域。要强调的是，液态活检在基础研究领域不是一个新的事物，鑫诺经过两年的技术积累和临床验证后，将成熟稳定的产品推向市场，接下来我们还会有更多相关产品和服务，包括通过液态活检+AMRS-PLUS技术进行肺癌早期筛查，我们正和国内权威医院开展相关临床验证。
未来液体活检突破性技术的预测
液态活检主要包括CTC、ctDNA和外泌体。很多人想知道谁好谁坏，谁优谁劣，做CTC的说CTC好，做ctDNA说做ctDNA的好，做外泌体的更觉得自己占领了制高点。从临床应用的角度来评价一项技术是否更代表应用趋势，包含几个因素：临床意义、技术稳定性、操作简便性、成本等。
本次活动的宣传口号是“一滴血告诉你”，但是现阶段的技术水平还远远达不到“一滴血“的程度。液态活检的突破口我认为有三个方面，第一点是样本保存问题，无论是ctDNA还是CTC，在完成处理之前，对保存的要求很高，这在一定程度上限制了样本的运输；第二点是样本处理，如何高效率的从复杂背景下得到相对纯净的检测靶标；第三点是检测过程，需要更高的灵敏度和特异性。
现阶段我们对CTC、ctDNA以及外泌体的研究已经有了一定程度的临床转化，但是也有很多问题呈现在面前。比如检测前接受化疗药物是否会影响检测结果，多大程度影响；如何寻找有效的检测靶点，将液态活检应用至早期筛查中；伴随着样本来源的变化，企业的商业模式也会有相应改变；液态活检是否准备好了面向消费者等。
群友提问：请刘总介绍下Fish跟Pcr在液体活检中的应用，特别是qPCR跟dPCR。
刘沛：FISH由于灵敏度限制，几乎无法在液态活检有所应用。PCR是目前最常见的基因检测技术，其特点是操作简便，设备简单，但是无法同时检测多个位点。数字PCR的技术原理和PCR相同，一种核酸分子绝对定量技术。相较于qPCR，数字PCR可让你能够直接数出DNA分子的个数，是对起始样品的绝对定量。
群友提问：肺癌早期检测有哪些方法？
刘沛：现在有很多的方法，一是通过免疫的方法找到抗体，这样的成本会比较低，二是通过研究肺癌早期发声与基因变化的相关性来筛查，这个通过PCR的技术也可以实现，费用也不会很高；三是借用二代测序，找到靶标，通过计算权重的方式来判断基因变化和可能出现的肺癌。癌症的早期筛查更关注的其实是不能有假阴性。
群友提问：请教刘总，目前在液体活检的上中下游里面，商业价值是如何分布的？
刘沛：上游是设备制造商，但是设备曝光后，怎么去设计产品是中游的事情，下游主要是医院和第三方检测机构、临床机构，这个商业价值主要分布在中游，因为它的核心价值在于中游产品的设计、临床的验证上。
群友提问：刘总好！液体活检是否可以做个体化订制，对于有家族史的健康人群做风险评估或癌前期的检测？
刘沛：可以定制，但是这个个性必须发展成一个共性，也就是说，一个客户的个性化定制要符合在全球范围内都存在这个需求，才能实现真正的商业价值。
